PNAS报道前列腺癌相关的RNA拼接因子参与调控circRNA形成

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声 明

        6月13日，PNAS杂志在线发表了一篇前列腺癌中筛选RNA拼接因子的文章，介绍基于CRISPR基因打靶文库筛选体系，鉴定到与前列腺癌有关的RNA拼接因子HNRNPL，该因子也参与调控了circRNA的形成过程[1]。文章的通讯作者为东北大学生命科学与健康学院“青年千人计划”费腾教授，哈佛大学公共健康学院/Dana-Farber癌症研究所X. Shirley Liu教授和Dana-Farber癌症研究所/哈佛大学医学院Myles Brown教授[1]。

        本文作者利用CRISPR的全基因组打靶文库筛选与前列腺癌有关的基因，聚类分析后找出了其中与RNA编辑有关的基因，其中HNRNPL是影响最为显著的。接下来作者分析了HNRNPL结合RNA的序列特异性，并基于RIP-Seq分析了该基因在前列腺癌细胞中调控RNA可变剪切和circRNA形成的作用[1]。

如何发现HNRNPL的？ 

        本文主要是基于CRISPR打靶文库筛选前列腺癌生长相关的基因，鉴定到的基因再根据通路和聚类分析，找出其中的RNA结合蛋白以及RNA拼接相关的调控因子，这其中发现了HNRNPL基因。那么作者是如何通过CRISPR打靶文库筛选相关基因的呢？

        首先在LNCaP前列腺癌细胞中利用GeCKO v2慢病毒gRNA文库进行感染。该文库共含有123411条gRNA，对应于19050个基因，平均每个基因有6条gRNA对应。经过嘌呤霉素筛选三天后的细胞收集，取一半作为Day 0对照，另一半继续培养14天，分别收取两个时间点的总DNA，进行sgRNA测序，比较培养前后sgRNA变化情况。14天后明显减少的sgRNA称为阴性变化， 14天后明显增多的sgRNA称为阳性变化。阴性变化对应的基因为细胞增殖相关的关键基因，是本文下一步分析的候选基因。而阳性变化的则是细胞增殖抑制基因。

图1 CRISPR打靶文库筛选前列腺癌关键基因的技术路线（来自[1]）

        作者首先收集了变化最明显的前1000个阴性基因，与已报道的其他10种细胞中的关键基因进行比较，其中有三分之一的基因是共有的，其余的大部分是LNCaP细胞特有的或者仅有少数几种细胞中出现的关键基因。

图2 LNCaP细胞特有的关键基因（来自[1]）

        大部分共有的关键基因主要与蛋白生成，核糖核蛋白，核糖体，蛋白酶体系统及细胞周期等有关。LNCaP细胞特有的关键基因则包括AR（雄激素受体）和PI3K通路，也包括已知的前列腺癌有关的重要基因，包括STAT3、PIAS1、PIK3C2A、AR和MYC等基因。针对这些LNCaP细胞特有的关键基因的通路分析会发现其中包含了与RNA剪切及核糖核蛋白等通路。

图3 LNCaP细胞特有的关键基因通路分析（来自[1]）

HNRNPL是 LNCaP细胞特有的生长关键基因之一

        为找出前列腺癌有关的RNA结合蛋白或剪切相关蛋白，作者进行聚类分析后，发现HNRNP家族的多个基因出现在列表中，包括HNRNPL、HNRNPC和FUS基因，其中HNRNPL是影响最显著的基因。

        为验证该结果，作者设计了RNA干扰试验，针对所有HNRNP家族基因进行RNA干扰，看其对细胞增殖的影响，每个基因设计两条siRNA。结果表明HNRNPL和HNRNPK的影响最显著。作者又额外针对这两个基因分别设计了另外两条siRNA，以减少脱靶效应的可能影响，同时也将实验的细胞类型扩大到去势耐性细胞（castration-resistant）CWR22RV1，AR阴性细胞DU145和PC3，肺肿瘤的前列腺上皮细胞RWPE-1。结果表明HNRNPK可以抑制上述所有细胞的增殖活动，而HNRNPL仅对前列腺癌细胞有抑制增殖的作用，对健康前列腺上皮细胞没有影响。因此，作者认为HNRNPL是前列腺癌特异性的基因。

图4 HNRNP家族基因干扰后对前列腺癌细胞增殖的影响（来自[1]）

HNRNPL结合RNA特性分析

        作为一种RNA结合蛋白，如何结合RNA是研究其功能的关键。作者采用RIP-Seq的方法进行分析。概括而言，就是利用甲醛交联法将內源的蛋白与RNA交联后进行IP，然后分离钓取到的RNA进行测序，最后找出结合位点的共性特征。作者在本项工作中共分析到了分布在1549个基因上的6892个结合位点。基因组定位分析表明绝大部分位点位于内含子和3’UTR区。HNRNPL的结合位点为CA重复/富集序列，与之前在其他细胞中的结果相一致。

图5 RIP-Seq分析HNRNPL的结合位点特征（来自[1]）

        为避免单一抗体带来的偏差（抗体结合可能影响RNA结合特性），作者用了两种不同的单克隆抗体进行RIP-qPCR验证，结果表明虽然结合能力有所差别，但都能很好的重现结果，说明所进行的RIP-Seq实验结果比较稳定可靠。作者还利用结合位点的RNA设计的探针进行RNA Pull-down实验，验证了HNRNPL结合RNA为链特异性的。

图6 HNRNPL结合位点验证（来自[1]）

在前列腺癌细胞中HNRNPL调控RNA的可变剪切

        HNRNPL倾向于结合内含子的特性意味着它在RNA剪切过程中发挥重要作用。于是作者首先基于RNA干扰试验，分析了HNRNPL相关的mRNA可变剪切形式。在Poly(A)+测序的结果中发现了206种mRNA的可变剪切，以跳跃外显子的可变剪切（SE）为主。有趣的是作者发现了其中包括AR基因的可变剪切。干扰HNRNPL后明显促进外显子2b进入成熟的mRNA但减少外显子2与3直接拼接的mRNA分子形式，前体RNA分子变化并不明显。

图7 HNRNPL调控RNA的可变剪切（来自[1]）

HNRNPL影响circRNA生成

        circRNA也可以视为RNA可变剪切的一种形式，自然需要讨论HNRNPL对circRNA的影响情况。HNRNPL基因干扰后通过RNase R消化测序，共找到了139种明显上调和93种明显下调的circRNA。这些上调的circRNA对应于较强的HNRNPL结合力。

图8 HNRNPL对circRNA的影响（来自[1]）

        同一个基因往往伴随着多种circRNA分子形式。以PPFIA2基因为例，RNA Pull-down实验和测序实验均证实了HNRNPL参与circRNA的形成。

图9 HNRNPL调控circRNA的形成（来自[1]）

        为进一步验证HNRNPL参与调控circRNA的形成过程，作者构建了一个细胞内circRNA形成的报告系统，用GAPDH基因的5和6号外显子和相关的内含子序列在特定位置分别插入20×的CA重复元件(CA)20，然后基于定量PCR看HNRNPL对circRNA的形成影响。结果表明HNRNPL的确参与调控了circRNA的形成。

图10 报告系统验证HNRNPL调控circRNA的形成（来自[1]）

HNRNPL与前列腺癌疾病相关性分析 

        作者最后分析了HNRNPL与前列腺癌的疾病相关性，表达谱分析和免疫组化分析均表明前列腺癌中HNRNPL表达增高。组学数据分析后表明，HNRNPL相关的可变剪切和circRNA均为前列腺癌相关的过表达基因。

图11 HNRNPL与前列腺癌疾病相关性（来自[1]）

        本文虽然不是专门研究circRNA的，但所发现的前列腺癌相关的RNA剪接作用调控蛋白HNRNPL是疾病特异性circRNA形成的重要原因，为解释疾病相关的circRNA变化提供了有价值的参考，也丰富了我们对circRNA形成机制的认识。

参考文献：

1. Fei, T., et al., Genome-wide CRISPR screen identifies HNRNPL as a prostate cancer dependency regulating RNA splicing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017.

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